基于模塊化設(shè)計(jì)的 DNA 高通量組裝助力合成生物學(xué)研究

合成生物學(xué)是一門(mén)交叉學(xué)科，未來(lái)很有可能對(duì)學(xué)術(shù)和工業(yè)方面的應(yīng)用產(chǎn)生重大的影響，包括生產(chǎn)新型治療藥物和疫苗、植物科學(xué)和生物燃料。其中許多學(xué)科都需要利用基于生物學(xué)的化工生產(chǎn)能力，將工程學(xué)原理應(yīng)用于生物學(xué)。其重點(diǎn)通常是從天然生物系統(tǒng)中產(chǎn)生、表征和分離某些天然物質(zhì)（如 DNA），并將其用作工程化生物路徑的組件。合成生物學(xué)的特點(diǎn)是將理性原則應(yīng)用于這些生物組件的設(shè)計(jì)和組裝，但即便是理性設(shè)計(jì)，引入外源 DNA 到細(xì)胞中的影響也很難預(yù)測(cè)，這就需要測(cè)試多種排列組合以獲得期望的結(jié)果。加強(qiáng)對(duì) DNA 片段的模塊化設(shè)計(jì)，就可以通過(guò)替換單個(gè)組件的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)多樣化的潛在的組裝構(gòu)建。DNA 片段的模塊化設(shè)計(jì)和組裝不僅可以簡(jiǎn)化整體的 DNA 構(gòu)建工作流程，還使自動(dòng)化組裝成為可能，減少完成多次構(gòu)建所需的時(shí)間、人力和成本，從而提高通量，并縮短總體開(kāi)發(fā)周期。

NEBuilder? 高保真 DNA 組裝和 NEBridge? Golden Gate 組裝引領(lǐng)著下一代克隆技術(shù)。這兩種方法都兼容高通量工作流程，并已經(jīng)成功通過(guò)自動(dòng)化平臺(tái)（例如 Labcyte?, Inc. 的 Echo? 525 液體處理系統(tǒng)和 SPT Labtech 的mosquito? LV 移液工作站）實(shí)現(xiàn)了高通量無(wú)縫克隆。

無(wú)縫組裝結(jié)合 Labcyte?, Inc. 的 Echo? 525 液體處理系統(tǒng)

使用納升級(jí)聲波移液系統(tǒng)實(shí)現(xiàn) PIK3CA 的模塊化 DNA 組裝

在此研究中，NEBuilder? HiFi 與 25 nL 移液量的 Labcyte Echo? 525 液體處理系統(tǒng)結(jié)合使用，來(lái)完成基于五個(gè)模塊化片段，可以編碼 PIK3CA 癌基因的組裝構(gòu)建。將這些模塊設(shè)計(jì)為分別包含發(fā)生于野生型 PIK3CA 上的四個(gè)活化突變：R38H、E542K、E545K 和 H1047R，將其克隆到 pcDNA?3.1/Zeo(+) 載體上，組裝成 8,940 bp 大小的質(zhì)粒。本實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)是利用 Echo 525 液體處理系統(tǒng)，在納升級(jí)別上完成五組五個(gè)片段的模塊化 DNA 組裝。該實(shí)驗(yàn)通過(guò) junction 菌落 qPCR 快速分析驗(yàn)證是否組裝成功，并通過(guò) Illumina? MiSeq? 測(cè)序進(jìn)行核苷酸水平上的驗(yàn)證。

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微型化多片段 DNA 組裝

在此應(yīng)用案例描述的研究中，NEB NEBuilder? 高保真 DNA 組裝克隆試劑盒與 Labcyte? Echo? 525 液體處理系統(tǒng)結(jié)合使用，基于五個(gè)模塊化片段進(jìn)行 DNA 組裝構(gòu)建。反應(yīng)體積可以縮小到說(shuō)明書(shū)推薦體積的 1/40，從而顯著節(jié)省試劑成本。在轉(zhuǎn)化到大腸桿菌之中后，首先通過(guò) junction 菌落 qPCR 檢查組裝構(gòu)建是否成功，然后，采用微型化的 Illumina? MiSeq? Nextera XT 方案進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，從而進(jìn)一步節(jié)省成本。

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利用 Labcyte? Echo? 525 液體處理系統(tǒng)和 NEBuilder 高保真克隆試劑盒進(jìn)行納升級(jí)DNA 組裝

在該實(shí)驗(yàn)中，將 NEBuilder? 高保真組裝試劑盒與 25 nL 移液量的 Labcyte? Echo? 525 液體處理系統(tǒng)相結(jié)合使用。通過(guò)組裝構(gòu)建兩種獨(dú)特的質(zhì)粒，展示了基于合理設(shè)計(jì)的模塊化合成生物學(xué)的優(yōu)勢(shì)。第一種組裝包含兩個(gè)片段，設(shè)計(jì)構(gòu)建可以表達(dá) LacZ 通路的 5223 bp 大小的質(zhì)粒，并在轉(zhuǎn)化到非 α 互補(bǔ)的菌株中時(shí)，能夠進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。第二種組裝由五個(gè)片段構(gòu)建 8,940 bp 大小的質(zhì)粒，更接近典型工業(yè) DNA 生產(chǎn)的復(fù)雜性和大小。兩片段組裝成功從 20 μL 推薦體積縮小到 100 nL，試劑用量只有原來(lái)的 1/200。對(duì)于更復(fù)雜的組裝，反應(yīng)體積成功降至原來(lái)的 1/80，而降至 1/40 時(shí)可以得到最穩(wěn)健的結(jié)果。當(dāng)反應(yīng)體積減小到 1/40 時(shí)，總反應(yīng)體積為 500 nL，每種 DNA 片段只需要 1.25 fmoles 的加入量。這些實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)是利用 Echo 525 液體處理系統(tǒng)，通過(guò)微量反應(yīng)體積，完成兩個(gè)片段和五個(gè)片段的組裝構(gòu)建。通過(guò) junction qPCR 快速分析驗(yàn)證組裝是否成功，并通過(guò) Sanger 測(cè)序在核苷酸水平上進(jìn)行驗(yàn)證。

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無(wú)縫組裝結(jié)合 SPT Labtech 的 mosquito? LV 移液工作站

基于自動(dòng)化高密度樣本存儲(chǔ)與微型化液體處理系統(tǒng)的高通量合成生物學(xué)組裝構(gòu)建

本應(yīng)用案例描述了一種自動(dòng)化、高通量的工作流程，該工作流程已由 GeneMill 合成生物學(xué)服務(wù)中心（由 James Johnson 博士領(lǐng)導(dǎo)，位于利物浦大學(xué)）集成用于構(gòu)建合成 DNA。

通過(guò)將 arktic 自動(dòng)化樣本管理系統(tǒng)與 mosquito X1/LV 小體積液體處理系統(tǒng)相結(jié)合，可以簡(jiǎn)化和加速 GeneMill 現(xiàn)有的手動(dòng)工作流程。這拓展了該核心機(jī)構(gòu)的 DNA 合成能力，有助于合成生物學(xué)研究人員獲得更多經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)工具。

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NEB 正在不斷將 NEBuilder? 高保真 DNA 無(wú)縫組裝和 NEBridge? Golden Gate 無(wú)縫組裝結(jié)合更多的自動(dòng)化平臺(tái)、多種組裝構(gòu)建設(shè)計(jì)和應(yīng)用場(chǎng)景進(jìn)行測(cè)試驗(yàn)證，致力于以低成本的方法和工作流程，構(gòu)建高質(zhì)量的合成 DNA，從而以較高的通量拓展基于設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)測(cè)試，并為科學(xué)家的研究提供更豐富的生物學(xué)場(chǎng)景。